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發布日期︰2020-01-23 作者︰ 點擊︰

磷脂黴固定化載體材料的研究進展


鮑 賽1,2,操麗麗1,2,龐 敏1,2,潘麗軍1,2,侯志剛1,2,
水龍龍1,2,李進紅1,2,姜紹通1,2
(1.合肥工業大學 食品科學與工程學院,合肥 230009; 2.安徽省農產品精深加工重點實驗室,合肥 230009)


摘要︰游離磷脂黴價格昂貴且穩定性差限制了其應用,固定化技術使黴穩定性增強,可以反復使用,降低了成本,極大地拓寬了黴的應用範圍。性能優良的固定化黴應具備成本低、穩定性高和催化活性高等特性。載體材料不僅是固定化黴的重要組成部分,還是影響固定化黴性能的因素之一。對磷脂黴固定化載體材料主要從無機材料、有機材料、復合材料以及無載體4個方面進行綜述,並對磷脂黴固定化載體材料發展方向予以展望,為固定化磷脂黴研究在載體材料上的選擇提供了參考依據。
關鍵詞︰磷脂黴;固定化;載體;材料
中圖分類號︰Q814.2;Q55    文獻標識碼︰A        文章編號︰1003-7969(2018)12-0050-05


Progress in carrier materials for immobilization of phospholipase
BAO Sai1,2, CAO Lili1,2, PANG Min1,2, PAN Lijun1,2,HOU Zhigang1,2,
SHUI Longlong1,2, LI Jinhong1,2, JIANG Shaotong1,2
(1.School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China;
2.Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province, Hefei 230009, China)


Abstract︰Expensive price and instability of the soluble phospholipases limit their application. Immobilization technology enhances the stability of the enzyme. The repeated use of the immobilized enzyme decreases the cost and greatly broadens the scope of application of the enzyme. The immobilized enzyme with excellent performance should have the characteristics of low cost, high stability and high catalytic activity. The carrier material is not only an important part of the immobilized enzyme, but also one of the factors affecting the performance of the immobilized enzyme. The carrier materials of phospholipases immobilization, such as inorganic materials, organic materials, composite materials and no carrier were reviewed. The future prospects of carrier materials were also addressed with the aim to provide a certain reference in the choice of materials in immobilization of phospholipase. 
Key words︰phospholipase; immobilization; carrier; material


  磷脂黴是一類存在于生物體內、能水解甘油磷脂的黴,在油脂中發揮重要作用。依據磷脂黴催化磷脂裂解位點的不同分為5類︰磷脂黴A1,磷脂黴A2,磷脂黴B,磷脂黴C和磷脂黴D。然而,磷脂黴在自然界中含量低,價格高昂,在酸、堿、熱和有機溶劑中不穩定,且難以回收利用,限制了其在工業上的應用。磷脂黴的固定化成為改進這些不足的關鍵。
     所謂固定化,就是將水溶性黴通過物理或化學方法束縛或者包埋在水不溶性載體中[1]。固定化磷脂黴在保留了磷脂黴特有的高效性和專一性的同時,也提高了磷脂黴的穩定性,極大地降低了成本,工業化操作變得簡單,使大規模工業化應用成為現實[2]。
     載體不僅是固定化黴的重要組成部分,還是影響固定化黴性能的因素之一[3]。選擇適宜的載體有利于提高固定化黴的各種性能。關于載體材料的選擇,可以從以下幾點考慮︰載體物化性質,如形狀、大小、孔徑、機械強度、耐酸堿、耐高溫和耐生物降解能力等;載體材料的獲得,載體材料廉價易得,是實現大規模工業化應用的關鍵;能否再生,對于價格昂貴的載體,再生利用能降低成本,環保節能等。合適的載體材料是黴固定化工藝研究的重點。本文對近幾年來磷脂黴固定化載體材料進行了綜述並予以展望。
1 無機載體材料
     無機材料是指能從自然界直接獲取的無機物或者混合其他物質制成的材料。無機材料具備廉價易得、機械強度大、耐酸堿、耐有機溶劑、耐微生物腐蝕等優點,但無機材料結構難以控制,與黴結合能力差。
     近幾年來,為獲得理想的無機載體材料,學者們通常會在無機材料表面修飾上活潑的功能基團或者利用新的固定化技術將磷脂黴固定在無機材料上。陶明等[4]使用 烷偶聯劑KH550水溶液對無機材料凹凸棒土進行活化,活化後的凹凸棒土用于固定化磷脂黴A1,顯示出較好的黴活回收率和熱穩定性。Li等[5]利用新的固定化技術對磷脂黴進行固定化,先使用5%的大豆卵磷脂對磷脂黴A1進行生物印跡,再通過無機材料 藻土對生物印跡後的磷脂黴A1固定化,固定化黴在卵磷脂-己烷溶液中的活性提高了30.9倍,顯著改善了磷脂黴A1在有機溶劑中的黴學性質。
     新型無機材料也成為固定化磷脂黴的考慮對象。新型無機材料是指近幾年開發的具有優異性能的無機材料,如無機納米材料、介孔分子篩。無機納米材料具備生物相容性良好、比表面積大等優點而成為固定化磷脂黴的優良載體材料[6]。其中,納米二氧化 對大分子物質吸附能力強,且含有功能基團而受到廣泛關注。Li等[7]以納米二氧化 為核心,通過吸附、沉澱和化學交聯等手段形成“黴網”覆蓋在其表面。固定化黴的黴活約為游離黴黴活的1.15倍。對固定化磷脂黴D黴學性質研究表明,與游離磷脂黴D相比,固定化磷脂黴D的熱穩定性明顯提高,pH適應性顯著增強,動力學研究表明固定化黴催化活性和黴與底物親和性增加。在4 ℃,固定化黴的半衰期為70 d,約為游離黴的2.3倍。在連續使用12批次後,固定化磷脂黴D的初始反應速率大于第一批次的50%,表明采用該材料固定化的磷脂黴D催化活性高,穩定性強。介孔分子篩憑借其內部孔徑可調、比表面積大和黴在孔道中易擴散等優點,成為固定化黴載體材料的熱點。介孔分子篩已被廣泛應用于固定化β-葡萄糖 黴[8]、青霉素G 化黴[9]等,但將其應用于固定化磷脂黴的研究仍處于空白。
2 有機載體材料
     有機載體材料是直接利用有機材料或對有機材料進行物理或化學改性制成的材料。有機材料包括天然高分子材料和合成高分子材料兩類。
2.1 天然高分子材料
     天然高分子材料來源于自然界中,是一種來源廣泛且取之不竭的可再生資源,具有無毒環保、容易改性和生物相容性良好等優點,常被作為固定化黴的載體材料。近年來,常用于磷脂黴固定化的天然高分子材料為天然多糖,如殼聚糖、縴維素和海藻酸鈉等。 
     殼聚糖化學性質穩定,耐熱性好,含大量活性基團氨基。孫萬成等[10]將殼聚糖、戊二醛與磷脂黴A1同時加入反應體系中,使載體、交聯劑和黴充分接觸,克服了傳統方法導致的黴活回收率偏低的缺陷。與此同時,固定化磷脂黴A1熱穩定性明顯提高,pH向堿性偏移,動力學反應表明固定化黴與底物親和力增強,有利于黴促反應。
     縴維素不易被微生物分解,且含有大量羥基,羥基能通過化學反應帶有多種活潑的官能團,而與黴上的官能團發生共價反應固定化黴。于殿宇等[11]以高碘酸鈉活化的縴維素濾紙膜固定化磷脂黴A1。與游離磷脂黴A1相比,固定化磷脂黴A1的pH耐受性和溫度穩定性增強。重復使用7次後,固定化磷脂黴A1催化活性仍有初始活性的65%以上。Fbd等[12]以三醋酸縴維素作為載體固定化磷脂黴,三醋酸縴維素比普通的縴維素更疏水,在脂肪黴固定化中表現出良好的性能,是固定化磷脂黴的良好候選載體材料。磷脂黴A1在三醋酸縴維素中的固定化率在60 min內達到97.1%,黴活為975.8 U/g。固定化後的磷脂黴A1具有良好的熱穩定性和pH穩定性。
     天然高分子材料安全無毒,符合綠色生產的要求,與黴結合能力良好,固定化條件溫和,操作簡易,具有廣闊的應用前景。天然高分子材料固定化磷脂黴已被成功應用于生產實踐中,如陳麗萍等[13]將海藻酸鈉固定的磷脂黴A1應用于大豆油脫膠,脫膠後測得大豆油中磷含量為9.87 mg/kg,符合油脂中低磷含量要求。
2.2 合成高分子材料
     合成高分子材料具備機械強度高、物理化學性質確定等優點而受到研究者們的喜愛。應用于磷脂黴固定化的合成高分子材料主要為合成樹脂類,合成樹脂大多通過簡單的吸附作用與磷脂黴結合,對黴結構的破壞較小。
     Liu等[14]以陰離子交換樹脂D202固定化磷脂黴A1,黴活達到1 682 U/g,黴活殘留率為33.0%。利用固定化黴催化大豆油甘油解生產功能性食用油甘油二酯(DAG),在45 ℃反應12 h,DAG產量為53.9%,與游離黴(54.7%)接近。固定化黴連續使用28批次後,DAG產量為31.8%,而游離黴在連續使用10次後,DAG產量僅21.9%。Li等[15]以D380樹脂對磷脂黴A1進行固定,得到的固定化黴活力為720.95 U/g。利用酯交換反應體系催化合成DHA/EPA型磷脂,固定化磷脂黴A1的催化效果遠高于游離磷脂黴A1。反應24 h後,以固定化磷脂黴A1作為催化劑,DHA/EPA總結合率為19.5%,然而以游離磷脂黴A1作為催化劑,DHA/EPA的總結合率僅為7.4%。固定化黴重復使用6次後,殘存的黴活力仍可達到48.9%。聚苯乙烯二乙烯苯樹脂[16]和D001樹脂[17]也被用于磷脂黴的固定化研究。
     以上結果表明,合成樹脂固定化磷脂黴催化活性優良,將其應用于生產實踐中,產品產量及固定化磷脂黴重復使用性均優于游離黴。此外,合成樹脂固定化磷脂黴還被用于大豆油脫膠[18]、催化制備果糖月桂酸單酯[19]、DHA型磷脂[20]、磷脂 絲氨酸[21]、富含共軛亞油酸磷脂[22]等中。 
3 復合載體材料
     復合材料是一種混合物,由兩種或兩種以上材料通過物理或者化學手段組合而成。復合材料的性能不單是簡單地單一材料性能的相加,還可能通過復合效應產生原材料不具備的新性能。常見的固定化磷脂黴復合材料包括天然高分子復合材料、合成-天然高分子復合材料以及無機-有機復合材料。
3.1 天然高分子復合材料

     將天然高分子材料如海藻酸鈉、殼聚糖和明膠組合是常見的固定化磷脂黴材料,如海藻酸鈉和殼聚糖復合物固定化磷脂黴A1[23]、磷脂黴A2[24],海藻酸鈉和明膠復合物固定化磷脂黴A1[25],最大黴活回收率均大于60%,重復使用性優良。與游離磷脂黴相比,固定化後磷脂黴的熱、pH穩定性均得到提高。張智等[26]分別采用海藻酸鈉、海藻酸鈉-殼聚糖和海藻酸鈉-明膠為載體固定化磷脂黴A1。重復使用4次後,兩種復合材料固定化磷脂黴A1的相對黴活仍保留在80%左右,而以單一材料為載體固定化磷脂黴A1的相對黴活僅剩50%。研究表明,復合材料固定化磷脂黴的操作穩定性高于單一材料固定化磷脂黴。
     復合天然高分子材料提高了黴的穩定性和重復使用率,擴大了固定化磷脂黴的應用範圍。目前,復合天然高分子材料固定化磷脂黴主要用于油脂脫膠,如海藻酸鈉和殼聚糖的復合材料固定化磷脂黴用于大豆油脫膠[27]和菜籽油脫膠[28],海藻酸鈉和明膠的復合材料固定化磷脂黴用于冷榨菜籽油脫膠[29],脫膠效果均較好。
3.2 合成-天然高分子復合材料
     合成-天然高分子復合材料固定化磷脂黴,兼具合成高分子材料和天然高分子材料的優點。時敏等[30]將縴維素衍生物醋酸縴維素制成鑄膜液,涂在聚四氟乙烯基膜表面,得到復合膜固定化磷脂黴A1。聚四氟乙烯基膜為多孔狀結構,有利于黴分子的附著,醋酸縴維素提供活性基團。固定化磷脂黴A1的最大黴活力為4.0 U/cm2。Zhan等[31]將一定量的磷脂黴A1溶液加入充分溶解的海藻酸鈉和聚乙烯醇溶液中,然後注入硼酸和氯化鈣混合溶液中,浸泡若干分鐘,形成微球。聚乙烯醇提高了微球的機械強度,海藻酸鈉形成多孔結構有利于磷脂黴A1進入且能抑制微球聚集在一起。固定化磷脂黴A1最高黴活達到126.50 U/g,固定化效率達到85 32%。重復使用8次後,固定化磷脂黴A1仍然保留了50.37%的初始黴活。在4 ℃儲存6周後,固定化磷脂黴A1黴活為初始黴活的78.58%。
     固定化黴的催化活性、重復使用性和操作穩定性都較好,且結合了兩種材料的優點,但目前對于合成-天然高分子材料固定化磷脂黴的研究較少。 
3.3 無機-有機復合載體材料
     無機-有機復合材料固定化磷脂黴,多采用有機高分子材料包裹無機納米粒子形成納米復合微球固定化磷脂黴。梁江[32]以殼聚糖包裹納米二氧化 為載體固定化磷脂黴D,納米二氧化 提供核,殼聚糖提供大量活性基團。固定化黴催化效率是游離黴的1.16倍,pH耐受性變寬;重復使用7次後,仍有60%的殘余黴活;保存70 d後,黴活剩余50%。
     復合納米微球催化活性、操作和儲藏穩定性均良好,但復合納米微球從反應體系中分離回收困難,易造成損失[33]。磁性納米微球由磁性納米粒子與有機材料復合而成。磁性納米粒子表面可通過包裹或接枝作用結合含多種功能基團的有機材料。通過外部磁鐵作用,固定化黴與反應體系能快速分離;撤除外部磁鐵,固定化黴能穩定懸浮在反應體系中。因此,磁性納米微球是良好的固定化黴材料[34]。
     Yu等[35]使用Fe3O4/SiOx-g-P(GMA)磁性納米微球固定化磷脂黴A1,掃描電子顯微鏡結果表明形成的納米微球直徑約為250 nm。在最優條件下,固定化效率為64.7%,黴活為2 066.67 U/g。與游離磷脂黴A1相比,固定化磷脂黴A1的pH和溫度穩定性更好。將固定化黴用于大豆油脫膠,脫膠7 h後,脫膠油中磷含量為9.6 mg/kg,低于傳統的水化脫膠(<10 mg/kg)。55 ℃脫膠10次後,殘余黴活為初始黴活的80%以上。Qu等[36]使用該載體固定化磷脂黴A2,得到的黴固載率及催化活性最大,分別為122.60 mg/g和1 289 U/g,用于大豆油脫膠,脫膠油磷含量為9.8 mg/kg,使用5次後,黴活損失較小。目前,磁性納米微球越來越受到國內外研究者的重視,如固定化堿性蛋白黴[37]、脂肪黴[38-39],但將磷脂黴固定在磁性納米粒子上的研究並不多見。
4 無載體——交聯黴聚集體(CLEAs)
     CLEAs不需要載體,操作簡單,黴活性中心未被破壞,黴活回收率極高,極具開發價值[40]。魚園[41]以磷脂黴D制備CLEAs,最大催化活性為15 62 U/mg,黴活回收率為86%,重復使用10個批次後,黴活為初始黴活的55%。然而,無載體固定化黴難以回收、機械強度差,因此人們考慮對CLEAs進行改進。王妍等[42]將磷脂黴A1制備成CLEAs,然後使用海藻酸鈣凝膠進行包埋,增強了機械強度,克服了其不易回收的缺陷。固定化黴的耐熱性高于游離黴,且更耐堿;重復使用6個批次後,固定化黴黴活仍保持65%以上。
5 結束語
     對磷脂黴固定化載體材料的研究從未停止,由早期的單一材料發展到復合材料,由直接使用自然界的已有材料到對已有材料進行改性和使用新型材料,有效提高了磷脂黴的穩定性和催化活性,擴大了磷脂黴的應用範圍。對磷脂黴固定化載體材料的選擇,需要綜合考慮多方面因素,包括載體材料的來源、理化性質、應用環境等,優良的載體材料需要與黴及應用相匹配。隨著化工、材料和生物技術的發展,根據磷脂黴特性和固定化需要設計制備性能優良的載體將成為磷脂黴固定化材料的重要選擇方向,這需要研究者們更深入掌握磷脂黴的物化特性和應用環境。
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